การตรวจหาเอนไซม์ beta-lactamases

    การตรวจสารที่เกิดจาการสลายตัวโดยการ hydrolyse ที่ beta-lactam ring ของ penicillin หรือ cephalosporin แล้วให้ product ที่ค่อนข้างอยู่ตัว ซึ่งมีหลายวิธีการ(8) คือ

  1. Iodometric method

    หลักการ คือ beta-lactamases จะ hydrolyse beta-lactam ring ของแบคทีเรียให้ dibasic acid คือ penicilloic acid จะดึง iodine จาก iodine-strach complex ที่มีสีน้ำเงินหมดไป

  1. Acidimetric methods

    หลักการ คือ beta-lactamases จะ hydrolyse penicillin ที่ beta-lactam ring ให้กรด penicilloic acid ซึ่งจะไปเปลี่ยนสีของ pH indicator

  1. Chromogenic cephalosporin methods

    หลักการ คือ nitrocefin ซึ่งเป็น cephalosporin เมื่ออยู่ในสารละลาย pH 7.0 จะมี absorption peak ที่ 370 นาโนเมตร จะปรากฏให้เห็นสีเหลือง แต่เมื่อถูก  beta-lactamases hydrolyse ที่ amide bond ของ beta-lactam ring จะเกิดสารใหม่ซึ่งมี absorption peak  486 นาโนเมตร และปรากฏให้เห็นเป็นสีแดง

  1. Inhibition ( Clover-leaf ) method

    หลักการ  การเพาะ Indicator strain ที่ไม่สร้าง beta-lactamases ร่วมกับแบคทีเรียที่ต้องการทดสอบบนอาหารที่มี penicillin ถ้าแบคทีเรียที่ต้องการทดสอบไม่สร้าง penicillinase ออกมาทำลาย penicillin มีผลให้ indicator strain ไม่สามารถขึ้นบริเวณที่มี penicillin แต่แบคทีเรียที่ทดสอบสร้างเอ็นไซม์ทำลาย penicillin มีผลให้ Indicator strain สามารถขึ้นได้ในบริเวณดังกล่าว ในการทดสอบดั้งเดิมของ Hodge จะมีลักษณะที่แบคทีเรียขึ้นบริเวณ inhibition zone เหมือนใบไม้สามแฉกคล้าย clover leaf

การทดสอบหาเอนไซม์ ESBLs

Screening test

    CLSI แนะนำให้ใช้ screening agent ซึ่งประกอบด้วย cefotaxime, cetriazone, ceftazime, cefpodoxime และ aztreonam ถ้าเชื้อแบคทีเรียให้ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของ inhibition zone น้อยกว่าที่กำหนดอย่างน้อย 1 ชนิดของสารต้านจุลชีพที่นำมาทดสอบให้ถือว่า screening test บวกต้องทำการทดสอบยืนยันต่อ

Confirmatory test มีหลายวิธี ได้แก่

1.  Double disc method

    เปนวิธีที่พัฒนาขึ้นโดยอาศัยหลักวา ESBLs ถูกยับยั้งดวยสารตาน beta-lactamases จึงใช clavulanic acid ใน amoxicillin/clavulanic acid (AMC) ซึ่งมีในห้องปฏิบัติการแบคทีเรียทั่วไปและดัดแปลงจากวิธี disc diffusion โดยวางแผนยา (disc) AMC ห่างจากจุดกึ่งกลางของ third generation cephalosporins ระยะประมาณ 2.5 cm. เพื่อให้เห็น extra zone ซึ่งเกิดจากการที่ clavulanic acid สามารถยับยั้ง เอ็นไซม์ได้ เชื้อจึงถูกยับยั้งการเจริญเติบโตได้

2.  Combined disc method

    ใชหลักการเดียวกับวิธี Double disc โดยใช้แผนยาที่มี extended-spectrum cephalosporin (ESC) เพียงอยางเดียว กับเเผนยาที่มี ESC รวมกับ clavulanic acid โดยดูการ diffusion เปรียบเทียบ inhibition zone ของ disc ยาทั้งสองซึ่ง Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ของสหรัฐอเมริกา ไดแนะนําใหเปรียบเทียบระหวาง

–  Cefotaxime (30 µg)  กับ cefotaxime + clavulanic acid (30/10 µg)

–  Ceftazidime (30 µg) กับ ceftazidime + clavulanic acid (30/10 µg)

โดยถ้า Inhibition zone ของแผนยาที่มี clavulanic acid กวางกวาแผ่นยาที่ไมมี clavulanic acid มากกว่าหรือเท่ากับ 5 mm แสดงวา เชื้อสราง ESBLs

3. Broth dilution method

    เป็นวิธี dilution  ตามวิธีมาตรฐาน broth dilution ของ CLSI โดยเปรียบเทียบMinimum Inhibitiory Concentration (MIC) ระหวางหลอดที่ใส  extended-spectrum cephalosporin (ESC)  เพียงอยางเดียว   กับ MIC ของหลอดที่ใส ESC รวมกับ clavulanic acid โดยหลักการเชนเดียวกับวิธี combined disc สําหรับการวัด MIC ทําโดยการเจือจางสารตานจุลชีพจากมากไปนอยแลวใส clavulanic acid ลงในทุกหลอดให้ได้ความเข้มข้น 4 µg/ml  คา MIC ที่ลดลงจากการใส่ clavulanic acid มากกว่าหรือเท่ากับ 3 two- fold dilution (≥ 8 เท่า) แสดงว่าเชื้อสราง ESBLs

4. E-test method

    ESBLs E-test เกิดจากบริษัทผูผลิต E-test ไดนําวิธี combined disc มาผสมผสานกับวิธี dilution โดยทําใหมีสารตานจุลชีพทั้งสองดานของแถบยา (double-ended strips) ด้านหนึ่งจะมีระดับความเขมขน ของ cefotaxime และอีกด้านหนึ่งมีระดับความเข้มข้นของ cefotaxime ร่วมกับ clavulanic acid อัตราสวนระหวาง MIC ที่มีและไมมี clavulanic acid (ซึ่งอยูคนละดานของเเถบ E-test) มากกว่าหรือเท่ากับ 3 two-fold dilution (≥ 8 เท่า) แสดงวา เชื้อสราง ESBLs

5. การใช้เครื่องอัตโนมัติ VITEK

    เป็นวิธีการที่ใช้เวลาในการ Incubate น้อยกว่าวิธี broth dilution และ Agar dilution ยังสามารถส่งข้อมูลแบบ LIS ได้ แต่วิธีนี้ใช้เครื่อง และ card ที่มีราคาแพงทำให้มีราคาต่อผลการทดสอบสูง

6. วิธีทาง Molecular เช่น PCR

การรายงานผล

    เชื้อที่ตรวจพบวาสราง ESBLs ดวยวิธีดังที่กลาวมาแลวนี้ ถือวาเชื้อดื้อตอ extended-spectrum cephalosporins โดยไมตองคํานึงถึงผลที่ไดรับจากการทดสอบความไวตอสารตานจุลชีพ และ เชื้อ Enterobacteriaceae อื่นๆ นอกจาก Klebsiella spp. และ E. coli ตรวจพบ ESBLs นอยหรือไดยากเช่น เชื้อ Enterobacter spp. และ Citrobacter freundii เป็นต้น มักจะสร้าง inducible AmpC chromosomal enzyme ซึ่งจะถูกชักนํา (induce) ใหสรางเอนไซม์นี้ดวยและจะไม่ถูกยับยั้งด้วย clavulanic acid ทําให้ไมสามารถเห็นผลการเสริมฤทธิ์ (synergy) จากการยับยั้ง ESBLs ดวยฤทธิ์ของ clavulanic acid


 
%d bloggers like this: