ผลการทดลอง

การวิจัยนี้เป็นการศึกษาเชื้อ Enterobacteriaceae ที่แยกได้จากตัวอย่างตรวจผู้ป่วยที่เข้ามารักษาที่โรงพยาบาลรามาธิบดี ในเดือนมีนาคมและเมษายน พ.ศ. 2548 จำนวน 133 ตัว ประกอบด้วย Escherichia coli จำนวน 71 ตัว, Klebsiella pneumoniae จำนวน 36 ตัว, Proteus spp. จำนวน 16 ตัว, Enterobacter spp. จำนวน 8 ตัว และ Citrobacter spp. จำนวน 2 ตัว โดยศึกษาในด้านต่างๆ ดังนี้

ความไวต่อสารต้านจุลชีพ
จากผลการทดลองความไวต่อสารต้านจุลชีพจำนวน16 ชนิดต่อ133 ตัว พบว่าเชื้อดื้อยาในกลุ่ม Beta-lactams ที่ทดสอบทุกชนิดยกเว้นยากลุ่ม carbapenem (imepinem, meropenem) พบเชื้อดื้อต่อ ampicillin มากที่สุด (85%) การดื้อยากลุ่มอื่นๆ เช่น sulfamethoxazole-trimethoprim, ciprofloxacin และ gentamicin พบเชื้อดื้อยา 48.9%, 34.6%, 24.8% ตามลำดับ (รูปที่ 10)

งาน13

รูปที่ 10 กราฟแสดงความไวต่อสารต้านจุลชีพของเชื้อที่แยกได้จากโรงพยาบาลรามาธิบดี ปี พ.ศ. 2548 จำนวน 133 isolates


กลไกการดื้อยา

กลไกหลักที่ก่อให้เกิดการดื้อยา Beta-lactams ของเชื้อ Enterobacteriaceae คือการสร้างเอนไซม์ Beta-lactamases โดยเอนไซม์ที่ก่อให้เชื้อดื้อต่อ Extended-spectrum beta-lactams ที่สำคัญคือ Extended-spectrum beta-lactamase (ESBLs) และ AmpC

1. การสร้างเอนไซม์ Extended-spectrum Beta-lactamase (ESBLs)

1.1 วิธีการทดสอบ

ในการทดสอบ screening ESBLs ต่อยา 5 ชนิดคือ cefpodoxime, ceftriazone, aztreonam, cefotaxime และ ceftazidime พบเชื้อให้ผลบวก 55 isolates แต่เมื่อทดสอบยืนยันพบเชื้อสร้างเอนไซม์ ESBLs รวมทั้งสิ้น 48 isolatesโดยเชื้อที่สร้างเอนไซม์ ESBLs มีรูปแบบความไวต่อสารต้านจุลชีพในการใช้เกณฑ์การ screening ESBL ตามมาตรฐาน CLSI ทั้งสิ้น 10 รูปแบบ โดยพบรูปแบบที่ให้ผลบวกกับยาทั้ง 5 ชนิดสูงสุด 50.9% และให้ผลบวกกับยา 4 ชนิด ยกเว้น ceftazidime จำนวน 14.5 % และรูปแบบอื่นๆไม่เกิน 1-3 isolates โดยการใช้ disc ยา aztreonam, cefpodoxime, ceftriaxone และ cefotaxime สามารถตรวจหา ESBLs ได้ดี โดยตรวจพบ 45 isolates (93.8%), 42 isolates(87.5%), 42 isolates (87.5%) และ 41 isolates (85.4%) ตามลำดับ ในขณะที่ ceftazidime มีความไวในการตรวจการสร้าง ESBLs ได้เพียง 33 isolates (68.8%) ซึ่งถ้าใช้ยา ceftazidime และ cefotaxime 2 ชนิด (ยาที่ใช้ในการทดสอบยืนยัน) สามารถครอบคลุมเชื้อได้ 89.6% แต่จากการศึกษานี้พบว่า ควรทดสอบอย่างน้อย 2 ชนิด คือ aztreonam และ cefotaxime เพื่อให้สามารถ screening ESBLs ได้ครบทุกตัว (ตารางที่ 6)

ในการทดสอบหาเอนไซม์ ESBLs พบเชื้อสร้าง ESBLs ทั้งสิ้น 48 ตัวโดยให้ผลบวกโดย confirmatory test ด้วยวิธี combined disc จำนวน 41 isolates และเมื่อใช้วิธี double disc ที่วาง 3rd generation cephalosporin คู่กับ amoxicillin-clavulanic acid ให้ผลบวกเพิ่มขึ้น 1 isolate ส่วนเชื้อที่screening ESBLs test ให้ผลบวก และดื้อต่อยา cefoxitin ให้ทำการทดสอบหาเอนไซม์ ESBLs ด้วยวิธี double disc (ในกรณีที่มีเอนไซม์ AmpC อาจจะทำให้เกิด false negative ในการหาเอนไซม์ ESBLs ด้วยวิธีข้างต้น) โดยใช้ยากลุ่ม 4th generation cephalosporin คู่กับ amoxicillin-clavulanic acid พบว่า เชื้อให้ผลบวกเพิ่มขึ้นอีกจำนวน 6 isolates


ตารางที่ 6 Antimicrobial susceptibility pattern ต่อ screen ESBLs disc ของเชื้อที่ให้ผล ESBLs positive

CPD

CRO

ATM

CTX

CAZ

ESBLs

1

+

+

+

+

+

28 (50.9%)

2

+

+

+

+

8 (14.5%)

3

+

0

4

+

0

5

+

+

3 (5.5%)

6

+

+

2 (3.6%)

7

+

+

+

+

2 (3.6%)

8

+

+

+

1 (1.8%)

9

+

+

+

+

1 (1.8%)

10

+

+

+

1 (1.8%)

11

+

+

+

+

0

12

+

0

13

+

1 (1.8%)

14

+

+

1 (1.8%)

Note: CPD: cefpodoxime; CRO: ceftriazone; ATM: aztreonam; CTX: cefotaxime;

CAZ: ceftazidime; ESBLs: extended spectrum beta-lactamases

1.2 อุบัติการณ์ของ CTX-M ESBL

ผู้ทดลองได้ศึกษาอุบัติการณ์การพบ CTX-M gene ของเชื้อทั้งหมด เนื่องจากมีรายงานพบการระบาดของเอนไซม์ CTX-M ในเชื้อ Enterobacteriaceae สูงทั่วโลก พบว่าการใช้ CTX-M primer ในกลุ่มเชื้อที่ไม่สร้าง ESBLs ทั้งหมด 85 isolates พบว่าให้ผลลบ เป็นจำนวน 84 isolates โดย 1 isolates นี้ให้ผล screening ESBLs บวกและให้ผลบวกทั้งกรณีที่ใช้เซลล์และ plasmid เป็น template ซึ่งอาจจะเป็น true positive หรือ false positive จึงบ่งชี้ได้ว่าวิธีนี้มีความจำเพาะสูง (specificity เท่ากับ 98.8%) และเมื่อทดสอบกับกลุ่มเชื้อที่สร้าง ESBLs (n=48) พบเชื้อมี CTX-M gene จำนวน 26 isolates คิดเป็น 54.2%

1.3 อุบัติการณ์ของ Multiple drug resistance

เมื่อศึกษาความไวต่อสารต้านจุลชีพของเชื้อที่สร้างเอนไซม์ ESBLs เปรียบเทียบกับเชื้อที่ไม่สร้างเอนไซม์ ESBLs ให้ผลดังตารางที่ 7 และ รูปที่ 11 พบว่ามีรูปแบบการดื้อต่อสารต้านจุลชีพทั้งสิ้น 13 รูปแบบ โดยเชื้อสร้าง ESBLs มีอุบัติการณ์การดื้อ beta-lactams ร่วมกับสารต้านจุลชีพกลุ่มอื่นๆ (ciprofloxacin, gentamicin และ co-trimoxazole) สูงที่สุด 27.1% และการดื้อ beta-lactams ร่วมกับ ciprofloxacin และ co-trimoxazole (16.7%) หรือ beta-lactams ร่วมกับ co-trimoxazole (14.6 %) ในขณะที่เชื้อไม่สร้าง ESBLs ส่วนใหญ่ (36.5%) ดื้อต่อ beta-lactams อย่างเดียว

ตารางที่ 7 การเกิด Multiple drug resistance ของเชื้อกลุ่มที่สร้างและไม่สร้าง ESBLs ต่อยากลุ่มต่างๆ

Antimicrobial susceptibility patterns

Number of

non-ESBLs (n=85)

Number of ESBLs (n=48)

Susceptible

17 (20%)

0

βr

31 (36.5%)

9 (18.8%)

CIPr

1 (1.2%)

0

SXTr

2 (2.4%)

0

βr and CIPr

3 (3.5%)

2 (4.2%)

βr and GMr

1 (1.2%)

1 (2.1%)

βr and SXTr

12 (14.1%)

7 (14.6%)

CIPr and SXTr

1 (1.2%)

0

GMr and SXTr

1 (1.2%)

0

βr, CIPr and GMr

0

3 (6.3%)

βr, GMr and SXTr

2 (2.4%)

5 (10.4%)

βr, , CIPr and SXTr

6 (7.1%)

8 (16.7%)

βr, , CIPr , GMr and SXTr

8 (9.4%)

13 (27.1%)

Note:  βr = beta-lactams resistance;    CIPr = ciprofloxacin resistance

GMr = gentamicin resistance; SXTr = co-trimoxazole resistance

งาน14

รูปที่ 11 เปอร์เซนต์การเกิด Multiple drug resistance ของเชื้อกลุ่มที่สร้างและไม่สร้าง ESBLs ต่อรูปแบบการดื้อยาแต่ละกลุ่ม

S = susceptible; b = beta-lactam resistance; CIP = ciprofloxacin resistance;

GM = gentamycin resistance; SXT = sulfamethoxazole-trimethoprim resistance

2. การสร้างเอนไซม์ AmpC (Class C beta- lactamase)

2.1 วิธีการทดสอบ

เชื้อที่สร้างเอนไซม์ AmpC สามารถตรวจคัดกรองได้จากเชื้อดื้อต่อ cefoxitin (Indicator drug สำหรับเชื้อที่สร้างเอนไซม์ AmpC) โดยพบเชื้อดื้อต่อ cefoxitin จำนวน 20 isolates พบเชื้อเกิด antagonistic effect ระหว่าง carbapenem (imipenem, meropenem) หรือ cefoxitin กับ 3rd generation cephalosporin จำนวน 9 isolates นำเชื้อที่ให้ผลลบ (11 isolates) ไปทดสอบการสร้างเอนไซม์ AmpC ต่อด้วยวิธี cell lysis พบว่าให้ผลบวกทั้งหมด สรุปได้ว่า เชื้อทั้ง 20 isolates ที่ดื้อ cefoxitin สร้างเอนไซม์ AmpC ดังนั้นการทดสอบหาเอนไซม์ AmpC ด้วยวิธี antagonistic effect จะให้ผลครอบคลุมคิดเป็น 45% และถ้าทดสอบเพิ่มด้วยวิธี cell lysis สามารถตรวจพบเชื้อที่สร้างเอนไซม์ได้ทั้ง 100% ในขณะที่เมื่อนำเชื้อทดสอบโดยวิธี Tris-EDTA (AmpC disc) ซึ่งเป็นวิธีที่ง่ายและสะดวกกว่าวิธี cell lysis พบว่า เชื้อให้ผลบวกโดยการเห็น clover-leaf จำนวน 11 isolates (55%) จึงสรุปได้ว่าเชื้อทุกตัวที่ดื้อต่อ cefoxitin สร้างเอนไซม์ AmpC และการรายงานอุบัติการณ์ขึ้นกับวิธีการทดสอบที่ใช้

2.2 อุบัติการณ์ของ plasmid AmpC

นอกจากนี้คณะผู้วิจัยศึกษายีนควบคุมการสร้างเอนไซม์ AmpC ของเชื้อ โดยการตรวจหา plasmid AmpC ด้วยวิธี PCR ซึ่งการพบ plasmid AmpC มักทำให้เชื้อเกิดการดื้อยาต่อกลุ่ม 3rd generation cephalosporins อันจะทำให้เกิดปัญหาในการรักษา ซึ่งต่างกับ chromosomal AmpC มักไม่มีผลให้เกิดการดื้อต่อยากลุ่ม 3rd generation cephalosporin จากการศึกษาพบว่า เชื้อมี plasmid AmpC 5 isolates จากเชื้อ 20 isolates คิดเป็น 24%

2.3 อุบัติการณ์ของ Multiple drug resistance

เมื่อนำผลทดสอบความไวของสารต้านจุลชีพของเชื้อที่สร้างและไม่สร้าง AmpC ต่อยากลุ่มต่างๆ พบว่าเชื้อสร้างเอนไซม์ AmpC มีรูปแบบความไวต่อสารต้านจุลชีพ 4 รูปแบบเท่านั้น พบเชื้อ 65% ดื้อเฉพาะยากลุ่ม beta-lactams และเชื้อ 35% ดื้อต่อยากลุ่ม beta-lactams และยากลุ่มอื่นๆด้วย โดยพบการดื้อร่วมกับยากลุ่มอื่นๆอย่างน้อย 2-3 ชนิด ซึ่งเชื้อเหล่านี้พบว่าเป็นเชื้อที่สร้างทั้งเอนไซม์ ESBLs และ AmpC (ตาราง 8 )

อุบัติการณ์การสร้างเอนไซม์ ESBLs และ/หรือ AmpC ของเชื้อ

จากการศึกษาอุบัติการณ์ของเชื้อ 133 isolates พบว่าการสร้างเอนไซม์ ESBLs หรือ AmpC ของเชื้อ พบสูงในเชื้อบางชนิด คือ E. coli, K.pneumoniae และ Enterobacter spp. โดยพบว่า E. coli และ K.pneumoniae มีอุบัติการณ์การสร้างเอนไซม์ ESBLs คือ 37.4% และ 33.3% ตามลำดับ, Enterobacter spp. (n=9) ทุก isolates พบว่ามีการสร้าง ESBLs และ/หรือ AmpC โดยเชื้อ 5 isolates (55.5%) สร้างเอนไซม์ AmpC และ 4 isolates (44.5%) สร้าง ESBLs และ AmpC สำหรับเชื้ออื่นๆ เช่น Proteus spp. พบอุบัติการณ์สร้าง ESBLs หรือ AmpC คือ 6.3%  ส่วนอุบัติการณ์การสร้างเอนไซม์ ESBLs ของ Citrobacter spp. นั้นพบว่าสร้างเอนไซม์ ESBLs 100% แต่ยังไม่ใช่ค่าที่แท้จริงเพราะมีเพียง 2 isolates เท่านั้น (รูปที่ 12)


ตารางที่ 8 การเกิด Multiple drug resistance ของเชื้อกลุ่มที่สร้างและไม่สร้าง AmpC ต่อยากลุ่มต่างๆ

Antimicrobial susceptibility patterns

Number of non-AmpC

(n=113)

Number of AmpC

(n=20)

Susceptible

17 (15.0%)

0

βr

27 (23.9%)

13 (65%)

CIPr

1 (0.9%)

0

SXTr

2 (1.8%)

0

βr and CIPr

5 (4.4%)

0

βr and GMr

2 (1.8%)

0

βr and SXTr

19 (16.8%)

0

CIPr and SXTr

1 (0.9%)

0

GMr and SXTr

1 (0.9%)

0

βr, CIPr and GMr

3 (2.7%)

0

βr, GMr and SXTr

3 (2.7%)

4 (20%)

βr, CIPr and SXTr

13 (11.5%)

1 (5%)

βr, , CIPr , GMr and SXTr

19 (16.8%)

2 (10%)

Note:  βr = beta-lactams resistance;    CIPr = ciprofloxacin resistance

GMr = gentamicin resistance; SXTr = co-trimoxazole resistance

งาน15

รูปที่ 12 การสร้างเอนไซม์ ESBLs และ/หรือ AmpC ในเชื้อแต่ละชนิด


 
%d bloggers like this: