วัสดุอุปกรณ์ สารเคมีและวิธีการทดลอง

วัสดุและอุปกรณ์

  1. เชื้อที่ใช้ในการทดสอบ
  • เชื้อ Enterobacteriaceae ที่แยกได้จากโรงพยาบาลรามาธิบดี จำนวน 133 isolates
  • เชื้อแบคทีเรียควบคุม (control stains)

–          Escherichia coli ATCC 25922

–          Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

  1. อาหารเลี้ยงเชื้อ ประกอบด้วย
  • McConkey agar
  • Mueller-Hinton agar (MHA)
  • Trypticase soy broth (TSB)
  • Stock culture media
  1. การทดสอบทางชีวเคมี
  • Triple sugar iron agar (TSI)
  • Indole test
  • Motility test
  • Methyl red (MR) test
  • Voges-Proskauer (VP) test
  • Lysine decarboxylation (LD) test
  • Ornithine decarboxylation (OD) test
  • Citrate utilization test
  • Malonate utilization test
  • Phenylalanine deaminase (PD) test
  • Urease test
  • Mannitol fermentation test
  • Glucose fermentation test
  1. Antibiotic disc

สารต้านจุลชีพที่ใช้ในการทดสอบมีทั้งสิ้น 18 ชนิด ประกอบด้วย

Beta–lactams ประกอบด้วย

Penicillin  ได้แก่ ampicillin (10 µg)

β–lactams / β-lactamase inhibitor combination ได้แก่ amoxicillin-clavulanic acid (20/10µg), ceftazidime-clavulanic acid (30/10µg),

cefotaxime-clavulanic acid (30/10 µg)

Cephalosporins ได้แก่

Second generation cephalosporins ได้แก่ cefuroxime (30 µg)

Third generation cephalosporins ได้แก่ cefotaxime (30 µg), ceftazidime(30µg), cefpodoxime (10 µg) และ ceftriaxone(30 µg)

Fourth generation cephalosporin ได้แก่ cefepime (30 µg)

Cephamycins ได้แก่ cefoxitin (30 µg)

Carbapenems ได้แก่ imipenem (10 µg), meropenem (10 µg)

Monobactams ได้แก่ aztreonam (30 µg)

Aminoglycosides ได้แก่  gentamicin (10 µg), amikacin (30 µg)

Fluoroquinolones ได้แก่  ciprofloxacin (5 µg)

Folate pathway inhibitors ได้แก่  trimethoprim-sulfamethoxazole (1.25/23.75 µg)

วิธีการทดลอง

การเพาะแยกเชื้อ

นำเชื้อจาก Stock culture ที่แยกได้จากโรงพยาบาลนครปฐมมาเพาะเลี้ยงบน McConkey agar แล้วนำไปเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 35 °C นาน 18-24 ชั่วโมง จากนั้นนำโคโลนีที่ได้ไปทดสอบทางชีวเคมี ทดสอบความไวต่อยาต้านจุลชีพ และการเตรียม Template DNA สำหรับการทำ PCR

  1. การทดสอบทางชีวเคมี

1.1.   นำโคโลนีเดี่ยวบน McConkey agar มา inoculate ลง Trypticase soy broth (TSB) และอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 °C นาน 2-3 ชั่วโมง

1.2.  จากนั้นนำมาทดสอบทางชีวเคมี คือ TSI, Indole, MR, VP, Citrate, LD, OD, Urease, Malonate-PD, Motile, Mannitol และ Glucose fermentation test

1.3.   นำไปอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 °C นาน 24-48 ชั่วโมง แล้วแต่ชนิดของการทดสอบ จากนั้นอ่านผลการทดสอบและวินิจฉัย

  1. การทดสอบความไวต่อยาต้านจุลชีพ

2.1.   นำเชื้อจากตัวอย่างตรวจและเชื้อแบคทีเรียควบคุม (Escherichia coli ATCC 25922 และ Klebsiella pneumoniae ATCC 700603) มาเพาะบน McConkey agar และอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 °C นาน 18-24 ชั่วโมง

2.2.   เลือกโคโลนีที่มีลักษณะเหมือนกันมา 3-5 โคโลนี มา inoculate ลง TSB และอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 °C นาน 2 ชั่วโมง (growth method)

2.3.   นำไปปรับความขุ่นในน้ำกลั่นปราศจากเชื้อ ที่มีปริมาตร 3 ml วัดความขุ่นด้วยเครื่อง spectrophotometer ให้ได้ค่า OD600 = 0.05 (มีเชื้อ 106-108 CFU/ml)

2.4.   นำ swab ปราศจากเชื้อชุบน้ำกลั่นที่ปรับปริมาณเชื้อแล้วนำไปป้ายบน Mueller-Hinton agar (MHA) เป็น 3 ระนาบ  ให้เชื้อกระจายทั่วผิวของอาหารเพาะเชื้อทิ้งไว้ 3-5 นาที เพื่อให้ผิวหน้าของอาหารเพาะเชื้อแห้ง

2.5.   ใช้ forceps คีบแผ่นสารต้านจุลชีพมาวางบนอาหารเลี้ยงเชื้อ กดเบาๆ เพื่อให้แผ่นสารต้านจุลชีพติดกับอาหารเพาะเชื้อ โดยวางแผ่นสารต้านจุลชีพออกเป็น 3 plates (รูปที่ 1)

2.6.   อบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35 °C นาน 16-18 ชั่วโมง วัดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของ inhibition zone เป็น mm แล้วแปลผลตามตารางของ CLSI (ตารางที่ 1)

หมายเหตุ ในกรณีที่พบลักษณะของ double zone จะทำการวัดขนาดของเส้นผ่านศูนย์กลางของ zone ใน ยกเว้นยา trimethoprim-sulfamethoxazole ที่ต้องวัดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของ zone นอก เมื่อมีจำนวนเชื้อใน zone ในไม่ถึง 20% ของเชื้อ zone นอก บันทึกขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางที่วัดได้

2.7.   เชื้อควบคุม (E. coli ATCC 25922 และ K. pneumoniae ATCC 700603) ให้ทำเช่นเดียวกันกับเชื้อทดสอบ ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของ inhibition zone ต้องมีค่ายอมรับได้ตามตารางการแปลผลของ CLSI (ตารางที่2) จึงสามารถแปลผลการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อสารต้านจุลชีพทั้ง 3 plates ได้

งาน4

รูปที่ 1 แสดงการวางแผ่นสารต้านจุลชีพบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อในการทดสอบความไวต่อสารต้านจุลชีพ

: จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 1, : จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 2,  : จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 3

จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 1 วางยา

Imipenem 10 µg (IPM), Cefotaxime 30 µg (CTX), Cefoxitin 30 µg (FOX), Ceftazidime 30 µg (CAZ), Ceftazidime-clavulanic acid 30/10 µg (CAZ+CLA), Cefotaxime-clavulanic acid 30/10 µg (CTX+CLA)

จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 2 วางยา

Trimethoprim-sulfamethoxazole 1.25/23.75 µg (SXT), Ciprofloxacin 5 µg (CIP), Ampicillin 10 µg (AMP), Gentamicin 10 µg (GM), Cefuroxime 30 µg (CXM), Cefpodoxime 10 µg (CPD

จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 3 วางยา

Aztreonam 30 µg (ATM), Amikacin 30 µg (AN), Cefepime 30 µg (FEP),  Ceftriaxone 30 µg (CRO), Amoxicillin-clavulanic acid 20/10 µg (AMC), Meropenem 10 µg (MEM)

การแปลผลการทดสอบความไวต่อสารต้านจุลชีพ

จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 1

ใช้ในการแปลผลการดื้อยาด้วยกลไก ESBLs และ AmpC ที่ใช้วิธีทดสอบยืนยัน(confirmatory test) โดยวิธี Combined disc ในการแปลผลการดื้อยาด้วยกลไก ESBLs โดยถ้า inhibition zone ของ cefotaxime-clavulanic acid และ/หรือ ceftazidime-clavulanic acid มีขนาดกว้างกว่า 5 mm เมื่อเปรียบเทียบกับ cefotaxime และ/หรือ ceftazidime ตามลำดับ ให้รายงานผลเป็น ESBLs บวก (รูปที่ 2) และทำการแก้ผลความไวของยาต้านจุลชีพในกลุ่ม beta–lactams เป็น resistance ทั้งหมด ยกเว้น cephamycins และ carbapenems  ทั้งนี้การทดสอบคัดกรอง (screening test) ESBLs ต้องให้ผลบวกด้วย ตามตารางการแปลผลของ CLSI (ตารางที่ 3)

งาน5

รูปที่ 2 แสดง ESBLs บวกเมื่อทำการทดสอบยืนยันการสร้างเอนไซม์ ESBLs โดยวิธี Combined disc

สำหรับการดื้อยาด้วยกลไกการสร้างเอนไซม์ AmpC ให้สังเกต

  1. inhibition zone ของ cefotaxime พบลักษณะ antagonistic effect เนื่องจากเกิดการ induce เชื้อปล่อยเอนไซม์  AmpC โดย  imipenem และ/หรือ cefoxitin มีผลให้ยา cefotaxime ถูกยับยั้งได้ (รูปที่ 3)
  2. ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของ inhibition zone ของ cefoxitin ให้ค่าอยู่ในช่วงที่แปลผลว่า resistanceงาน6

รูปที่ 3 แสดงการเกิด antagonistic effect ระหว่าง imipenem กับ cefotaxime และ cefoxitin กับ cefotaxime

จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 2

ใช้ในการแปลผลความไวต่อสารต้านจุลชีพของเชื้อ Enterobacteriaceae ต่อ ampicillin, second generation cephalosporins และ  third generation cephalosporins  รวมทั้งสารต้านจุลชีพกลุ่มอื่น นอกเหนือจากกลุ่ม beta-lactams ได้แก่ trimethoprim-sulfamethoxazole, fluoroquinolones และ aminoglycosides โดยแปลผลตามตารางการแปลผลของ CLSI (ตารางที่ 1) โดย cefpodoxime ใช้ในการทดสอบคัดกรอง (screening ESBLs) ESBLs ซึ่งต้องมีขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของ inhibition zone ≤ 17 mm จึงจะถือว่าให้ผลบวก แต่ต้องแปลผลร่วมกับวิธีการทดสอบยืนยัน (confirmatory test) ด้วย ถ้าวิธีทดสอบยืนยันให้ผลบวกเช่นกันจึงสรุปได้ว่าเชื้อสร้างเอนไซม์ ESBLs

จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 3

ใช้ในการแปลผลความไวต่อสารต้านจุลชีพของเชื้อ Enterobacteriaceae ต่อ β-lactams/ β-lactamase inhibitor combination, third generation cephalosporins, fourth generation cephalosporins, carbapenems และ monobactams  รวมทั้งการทดสอบความไวต่อสารต้านจุลชีพกลุ่มอื่นนอกเหนือจากกลุ่ม beta-lactams ได้แก่ กลุ่ม aminoglycosides โดยแปลผลตามตารางการแปลผลของ CLSI ซึ่ง ceftriaxone และ aztreonam ใช้ในการทดสอบคัดกรอง ESBLs (screening ESBLs)   ซึ่งต้องมีขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของ inhibition zone  ≤ 25 mm และ ≤ 27 mm ตามลำดับ จึงจะถือว่าให้ผลบวก แต่ทั้งนี้ต้องแปลผลร่วมกับวิธีการทดสอบยืนยัน (confirmatory test) โดยดูจากการเกิด synergistic effect ระหว่าง amoxicillin-clavulanic acid และ ceftriaxone ถ้าวิธีทดสอบยืนยันให้ผลบวกเช่นกัน จึงสรุปได้ว่าเชื้อสร้างเอนไซม์ ESBLs

ตารางที่ 1 Zone diameter interpretative standards for Enterobacteriaceae

Test/Report

Group

Antimicrobial agent

Disc content

Zone diameter ,

Nearest Whole mm

Comment

R

I

S

PENICILLINS

A

Ampicillin

10 µg

≤13

14-16

≥17

β – lactams / β – lactamase inhibitor combinations

B

Amoxicillin-clavulanic acid

20/10 µg

≤13

14-17

≥18

CEPHEMS (PARENTERAL)

B

Cefoxitin

30 µg

≤14

15-17

≥18

B

Cefotaxime

30 µg

≤14

15-22

≥23

B

Ceftriaxone

30 µg

≤13

14-20

≥21

C

Ceftazidime

30 µg

≤14

15-17

≥18

CEPHEMS (ORAL)

B

Cefuroxime

30 µg

≤14

15-22

≥23

O

Cefpodoxime

10 µg

≤17

18-20

≥21

B

Cefepime

30 µg

≤14

15-17

≥18

CARBAPENEMS

B

Imipenem

10 µg

≤13

14-15

≥16

B

Meropenem

10 µg

≤13

14-15

≥16

MONOBACTAMS

C

Aztreonam

30 µg

≤15

16-21

≥22

AMINOGLYCOSIDES

A

Gentamicin

10 µg

≤12

13-14

≥15

B

Amikacin

30 µg

≤14

15-16

≥17

FLUOROQUINOLONES

B

Ciprofloxacin

5 µg

≤15

16-20

≥21

FOLATE PATHWAY INHIBITORS

B

Trimethoprim-sulfamethoxazole

1.25/23.75 µg

≤10

11-15

≥16

ตารางที่ 2 Acceptable limits for quality control strains used to monitor accuracy for disc diffusion testing of non-fastidious Organism (using Mueller-Hinton medium without blood or other supplements)

Antimicrobial agent

Disc content

Escherichia coli ATCC 25922

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

Amikacin

30 µg

19-26

Amoxicillin-clavulanic acid

20/10 µg

18-24

Ampicillin

10 µg

16-22

Aztreonam

30 µg

28-36

9-17

Cefepime

30 µg

31-37

Cefotaxime

30 µg

29-35

17-25

Cefoxitin

30 µg

23-29

Cefpodoxime

10 µg

23-28

9-16

Ceftazidime

30 µg

25-32

10-18

Ceftriaxone

30 µg

29-35

16-24

Cefuroxime

30 µg

20-26

Ciprofloxacin

5 µg

30-40

Gentamicin

10 µg

19-26

Imipenem

10 µg

26-32

Meropenem

10 µg

28-34

Trimethoprim-sulfamethoxazole

1.25/23.75 µg

23-29

ตารางที่ 3 Screening and confirmation test for ESBLs in Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca and Escherichia coli

Method

Initial Screen Test

Phenotypic Confirmatory test

Medium

Mueller-Hinton Agar

Mueller-Hinton Agar

Antimicrobial Disc Concentration

Cefpodoxime 10 µg   orCefotaxime    30 µg   or

Ceftazidime   30 µg   or

Ceftriaxone    30 µg   or

Aztreonam     30 µg

(the use of more than one antimicrobial agent for screening improves the sensitivity of detection)

Ceftazidime   30 µgCeftazidime-clavulanic acid   30/10 µg

And

Cefotaxime    30 µg

Cefotaxime-clavulanic acid   30/10 µg

Inoculum

Standard disc diffusion recommendations

Standard disc diffusion recommendations

Incubation conditions

Incubation length

Results

Cefpodoxime  zone  ≤ 17  mmCefotaxime     zone  ≤  27  mm

Ceftazidime    zone  ≤ 22  mm

Ceftriaxone     zone  ≤ 25  mm

Aztreonam      zone  ≤  27  mm

= may indicate ESBLs production

≥ 5 mm increase in a zone diameter for either antimicrobial agent tested in combination with clavulanic acid versus  its zone when tested alone = ESBLs

QC Recommendations

E. coli ATCC 25922 K. pneumoniae ATCC 700603

Cefpodoxime  zone  ≤  9-16 mm

Cefotaxime     zone  ≤ 17-25 mm

Ceftazidime    zone  ≤ 10-18 mm

Ceftriaxone     zone  ≤ 16-24 mm

Aztreonam      zone  ≤  9-17 mm

E. coli ATCC 25922 ≤ 2 mm increase in zone diameter for antimicrobial agent alone versus its zone when tested in combination with clavulanic acid K. pneumoniae ATCC 700603

≥ 5 mm increase in Ceftazidime-clavulanic acid  zone diameter

≥3 mm increase in Cefotaxime-clavulanic acid  zone diameter

การทดสอบเพิ่มเติม

1. ทดสอบการสร้างเอนไซม์ ESBLs

กรณีที่ screening test ของ ESBLs ให้ผลบวก แต่ confirmatory test โดยวิธี Combined disc ให้ผลลบ  จะทำการทดสอบเพิ่มเติมโดยทดสอบการสร้าง ESBLs ด้วยวิธี Double disc

1.1 ทดสอบโดยวาง amoxicillin-clavulanic acid คู่กับ third generation cephalosporins (ที่ให้ inhibition zone ประมาณ 15-20 mm) ให้จุดศูนย์กลางของยาทั้งสองห่างกัน 2.5 cm เพื่อดู synergistic effect เนื่องจาก clavulanic acid จะไปจับเอนไซม์ beta-lactamases ที่เชื้อสร้าง ทำให้ยา third generation cephalosporins สามารถออกฤทธิ์ ทำให้เห็น extra zone เกิดขึ้นระหว่างยาทั้งสอง โดยระยะทางที่วางมีผลต่อการเกิด synergistic effect (รูปที่ 4)

งาน7

รูปที่ 4 แสดงการเกิด synergistic effect ในการทดสอบยืนยันการสร้าง ESBLs โดยวิธี Double disc

1.2  กรณีที่เชื้อดื้อยา cefoxitin และผล screening ESBLs ให้ผลบวก ทดสอบการสร้าง ESBLs โดยการทดสอบวาง amoxicillin-clavulanic acid กับ cefepime ให้จุดศูนย์กลางของยาทั้งสองห่างกัน 2.5 cm เนื่องจากเชื้ออาจสร้างเอนไซม์ AmpC ซึ่งเอนไซม์นี้ไม่ถูกยับยั้งด้วย clavulanic acid ซึ่งตรงข้ามกับ ESBLs จึงอาจมีผลให้เกิด false negative ในการหา ESBLs ถ้าเชื้อที่ทดสอบสร้างเอนไซม์ ESBLs จะพบ synergistic effect  เกิดขึ้นระหว่าง amoxicillin-clavulanic acid กับ cefepime (รูปที่ 5)

งาน8

รูปที่ 5 แสดงการเกิด synergistic effect ในการทดสอบยืนยันการสร้าง ESBLs โดยวิธี Double disc สำหรับเชื้อดื้อยา cefoxitin

2.  การตรวจการสร้างเอนไซม์ AmpC

เอนไซม์ AmpC มีผลอาจทำให้เชื้อดื้อสารต้านจุลชีพกลุ่ม Extended spectrum beta-lactams เช่น third generation cephalosporins ได้ โดยวิธีการตรวจสอบมีทั้ง screening และ confirmatory test

2.1 Screening test

ทดสอบโดยวาง cefoxitin disc โดยเชื้อที่สร้าง AmpC ให้ผลดื้อต่อ cefoxitin

2.2 Confirmatory test มีหลายวิธี คือ

2.2.1 การเกิด antagonism ของ cefoxitin หรือ imipenem กับ third generation cephalosporins โดยมีระยะห่างระหว่าง cefoxitin กับ ceftazidime 2.5 cm และ cefoxitin กับ cefotaxime 2 cm ในขณะที่ระยะห่างระหว่าง imipenem กับ cefotaxime 2.5 cm

หากตรวจด้วยวิธีการเกิด antagonistic effect ให้ผลลบแต่เชื้อดื้อ cefoxitin (indicator drug) จะทำการทดสอบเพิ่มเติมโดยวิธี cell lysis และ AmpC disc method

2.2.2    การทำ cell lysis

1)      ขูดเชื้อที่ต้องการทดสอบ 4-5 โคโลนี เพาะเลี้ยงใน broth

2)      นำไปปรับความขุ่นในน้ำกลั่น วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 600 nm ให้ได้ค่าเท่ากับ 0.16

3)    ดูด suspension 1 ml ลงใน microcentrifuge tube จากนั้นนำไปปั่นที่ 10,000 rpm 1 นาที แล้วดูด Supernatant ทิ้ง  จากนั้นเติมน้ำกลั่นลงไปอีก 200 µl ผสมให้เป็นเนื้อเดียวกัน

4)      นำไป freeze 5 นาที และ thaw ที่ 37 °C 10 นาที ทำเช่นนี้จำนวน 10 รอบ

5)      ปั่นที่ 10,000 rpm 1 นาที เพื่อนำส่วนของ Supernatant มาทำการทดสอบต่อไป

6)      นำ E. coli ATCC 25922  มาปรับความขุ่นในน้ำกลั่น วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 600 nm ให้ได้ค่าเท่ากับ 0.05

7)    จากนั้นนำไปป้ายบนอาหารเพาะเชื้อ Mueller-Hinton Agar เป็น 3 ระนาบ ให้เชื้อกระจายทั่วผิวของอาหารเพาะเชื้อ

8)      ใช้ forceps คีบยา cefoxitin วางตรงกลาง plate

9)      ทำ Mueller-Hinton Agar ให้เป็นร่องที่มีขนาด 1 x 25 mm โดยห่างจากแผ่นยา

2 cm

10)   ดูด Supernatant ที่เตรียมไว้มา 50 µl ใส่ลงในร่อง

11)   นำไปอบเพาะเชื้อที่ 35 °C เป็นเวลา 16-18 ชั่วโมง แล้วอ่านผล

การอ่านผลและแปลผลการทดสอบการสร้างเอนไซม์ AmpC โดยวิธี cell lysis

ถ้าเชื้อที่ทำการทดสอบมี AmpC production เมื่อทำ cell lysis มีผลให้เชื้อ E. coli ATCC 25922 สามารถขึ้นใน inhibition zone ได้ เนื่องจากเอนไซม์ที่เชื้อสร้างทำให้เห็นลักษณะเป็น Clover-leaf (รูปที่ 6)

งาน9

รูปที่ 6 แสดงผลการทดสอบการสร้างเอนไซม์ AmpC ของ cell lysis โดยวิธี Clover-leaf

หมายเลข 1:  negative control, หมายเลข 2: เชื้อทดสอบที่สร้าง AmpC, หมายเลข 3: เชื้อทดสอบที่ให้ผลลบ

2.2.3        การทำ AmpC disc

1)    ใส่  Tris-EDTA (500-50 mM) 20 µl ลงบน disc sterile ทิ้งไว้ให้แห้ง เรียก disc นี้ว่า AmpC disc เมื่อต้องการใช้ให้หยดน้ำกลั่น 20 µl ลงบน AmpC disc ก่อนนำไปทดสอบ

2)    นำ E. coli ATCC 25922  มาปรับความขุ่นในน้ำกลั่น วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 600 nm  ให้ได้ค่าเท่ากับ 0.05  จากนั้นนำไปป้ายบนอาหารเพาะเชื้อ Mueller-Hinton agar เป็น 3 ระนาบ ให้เชื้อกระจายทั่วผิวของอาหารเพาะเชื้อ

3)    วาง cefoxitin disc บน plate และวาง AmpC disc ติดกับ cefoxitin โดยวางทั้งสองข้าง สามารถทดสอบจากการวาง  cefoxitin disc ทั้งสิ้นไม่เกิน 3 แผ่น/plate (รูปที่ 7)

4)    เขี่ยเชื้อที่ต้องการทดสอบมาหลายๆ โคโลนี ป้ายบน AmpC disc 1 เชื้อ/ 1 disc แล้วนำไปอบเพาะเชื้อที่ 35 °C เป็นเวลา 16-18 ชั่วโมง อ่านผล

งาน10

รูปที่ 7 แสดงการวาง cefoxitin กับ AmpC disc บนจานอาหารเลี้ยงเชื้อในการทดสอบการสร้างเอนไซม์ AmpC

การอ่านผลและแปลผลการทดสอบการสร้างเอนไซม์ AmpC โดยวิธี AmpC disc

ถ้าเกิดการเว้าของ inhibition zone ของ cefoxitin ที่ข้างใด แสดงว่าเชื้อที่อยู่บน AmpC disc ข้างนั้นสร้างเอนไซม์ AmpC ทำให้เห็นลักษณะเป็น Clover-leaf ได้ แต่ถ้าไม่มีการเว้าของ inhibition zone ของ cefoxitin แสดงว่าเชื้อที่อยู่บน AmpC disc ข้างนั้นไม่สร้างเอนไซม์ AmpC (รูปที่ 8)

งาน11

รูปที่ 8 แสดงผลการทดสอบการสร้างเอนไซม์ AmpC โดยวิธี AmpC disc

หมายเลข 1 เป็นเชื้อทดสอบที่สร้าง AmpC, หมายเลข 2 เป็นเชื้อทดสอบที่ให้ผลลบ

3. การตรวจหา CTX-M gene และ Plasmid AmpC โดยวิธี PCR

3.1 การเตรียม Template DNA

  • การเตรียม cell suspension
  1. นำเชื้อแบคทีเรียที่ต้องการตรวจมาเพาะบน McConkey agar แล้วนำไปอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35  °C นาน 18-24  ชั่วโมง
  2. นำโคโลนีเดี่ยวบน McConkey agar มา inoculate ลงใน Trypticase soy broth นำไปอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 35  °C นาน 2 ชั่วโมง
  3. ปรับความขุ่นในน้ำกลั่นปราศจากเชื้อ ให้ได้ค่าการดูดกลืนแสงที่ 600 nm  มีค่าเป็น 0.05  แล้วนำไปใส่ใน microcentrifuge tube 1 ml
  • การเตรียม Plasmid DNA โดยวิธี Alkaline lysis มีขั้นตอนดังนี้

1)    ขูดเชื้อที่เพาะเลี้ยงไว้ ประมาณ 1 loop ใส่ลงใน Tris.Cl (pH 8.0) 1 ml ใน microcentrifuge tube ผสมให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วย vortex, ปั่น 12000 rpm 1 นาที แล้วเท  Supernatant  ออก

2)      เติม Solution I  100 µl  ผสมให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วย vortex  ตั้งที่ไว้ที่อุณหภูมิห้อง นาน 5 นาที

3)      เติม Solution II  200 µl ผสมเบาๆ จนได้ solution เหนียวใส แช่ในน้ำแข็ง 5 นาที

4)      เติม Solution III 150 µl ผสมเบาๆ แช่ในน้ำแข็ง 3-5 นาที

5)      ปั่น 12,000 rpm 10 นาที ที่ 4 °C เก็บ Supernatant  ใส่ microcentrifuge tube ใหม่

6)    เติม Absolute alcohol ในปริมาตร 2 เท่าของ Supernatant ที่ได้จากข้อ 5) ผสมเบาๆ แล้วตั้งทิ้งไว้ที่ -20 °C อย่างน้อย 2 ชั่วโมง

7)      ปั่น 12,000 rpm 10 นาที ที่ 4 °C เท Supernatant ออก

8)    เติม 70% Ethanol 500 µl ผสมเบาๆ จากนั้นนำไปปั่น 12000 rpm 5 นาที แล้วเท Supernatant ออก คว่ำ tube จน pallet แห้งสนิท

9)      เติม sterile distilled water 40 µl จะได้ Plasmid DNA solution เก็บไว้ที่ 4 °C หรือ

-20 °C เพื่อนำไปศึกษาต่อด้วย gel electrophoresis

3.2 PCR reaction solution

1)  การเตรียม PCR reaction solution จะประกอบด้วยส่วนต่างๆ ดังตารางที่ 4 แต่ถ้าใช้ Plasmid DNA เป็น Template ให้ใช้ Plasmid DNA 1 µl และเติม sterile distilled water จนได้ปริมาตรสุทธิเป็น 20 µl

ตารางที่ 4 แสดงส่วนประกอบต่างๆ ของ PCR reaction solution

Component

Volume (µl)

10x PCR buffer

2.0

25 mM MgCl2

1.2

2 mM dGTP

2.0

2 mM dATP

2.0

2 mM dCTP

2.0

2 mM dTTP

2.0

Forward  primer

1.0 (20 µM)

Reverse primer

1.0 (20 µM)

Template DNA (cell at OD600 = 0.05)

4.6

Taq DNA polymerase (1 unit/µl)

0.2

Final volume

20 µl (add distilled water)

2)  ผสม PCR reaction solution ให้เข้ากัน จากนั้นนำเข้าเครื่อง PCR โดยใช้อุณหภูมิ

เวลา และจำนวนรอบ ตามตารางที่ 5

ตารางที่ 5 แสดงขั้นตอนการทำปฏิกริยา PCR

Step

Temperature

Time

Number of cycles

Initial denaturation

94 °C

10 min

1  cycle

Denaturation

Annealing

Extension

94 °C

51 °C

72 °C

30  sec

1 min

1.30 min

30 cycles

Final extension

72 °C

10 min

1 cycle

Soak

4 °C

α

1 cycle

3)  หลังจากนั้นนำไปเก็บไว้ที่ 4 °C เพื่อนำไปแยกด้วย Agarose gel electrophoresis

การตรวจหา CTX-M gene และ Plasmid AmpC โดย Agarose gel electrophoresis

  1. เตรียม 1.5% Agarose gel ใน 1X TAE buffer นำไป microwave ให้ละลายเป็นเนื้อเดียวกัน
  2. เตรียม Chamber กับ Comb เข้าด้วยกัน
  3. เท Agarose gel ที่ละลายแล้วลงใน Chamber ทิ้งให้แข็งตัว แล้วค่อยดึง Comb ออก
  4. นำ Agarose gel ที่มีถาดแม่พิมพ์ไปวางลงใน Electrophoresis chamber เติม 1X TAE buffer ให้ท่วมผิวหน้า gel
  5. ดูด loading dye 2 µl ผสมกับ PCR products 4 µl แล้วหยอดลงใน well ที่ต้องการ
  6. หยอด marker (100 bp DNA ladder plus) หลุมละ 2  µl
  7. ต่อวงจรกระแสไฟฟ้าตรง เข้ากับ Electrophoresis chamber ให้ตรงขั้วประจุไฟฟ้า โดยขั้วลบอยู่ด้าน loading well จ่ายกระแสไฟฟ้าที่ความต่างศักย์ 100 volts เป็นเวลา 20 นาที โดยดูจากสีที่เคลื่อนไปอยู่ที่ปลาย gel ประมาณ 1 นิ้ว จึงหยุดกระแสไฟฟ้า
  8. นำ Agarose gel ที่ได้ไปย้อมด้วยสารละลาย Ethidium bromide (EtBr) 5 นาที หลังจากนั้น นำ Agarose gel ไปแช่ในน้ำกลั่น 10 นาที
  9. นำ Agarose gel ไปส่องดูด้วยเครื่อง UV Transilluminator เพื่อดูแถบของ DNA และทำการถ่ายรูปบันทึกไว้ (รูปที่ 9)งาน12

รูปที่ 9 (ก) แสดงแถบของ product เมื่อทำการตรวจหา CTX–M gene

(ข) แสดงแถบของ product เมื่อทำการตรวจหา Plasmid AmpC

<!–[if !mso]> <! st1\:*{behavior:url(#ieooui) } –>

รูปที่ 1 แสดงการวางแผ่นสารต้านจุลชีพบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อในการทดสอบความไวต่อสารต้านจุลชีพ

: จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 1, : จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 2, : จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 3

จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 1 วางยา

Imipenem 10 µg (IPM), Cefotaxime 30 µg (CTX), Cefoxitin 30 µg (FOX), Ceftazidime 30 µg (CAZ), Ceftazidime-clavulanic acid 30/10 µg (CAZ+CLA), Cefotaxime-clavulanic acid 30/10 µg (CTX+CLA)

จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 2 วางยา

Trimethoprim-sulfamethoxazole 1.25/23.75 µg (SXT), Ciprofloxacin 5 µg (CIP), Ampicillin 10 µg (AMP), Gentamicin 10 µg (GM), Cefuroxime 30 µg (CXM), Cefpodoxime 10 µg (CPD

จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 3 วางยา

Aztreonam 30 µg (ATM), Amikacin 30 µg (AN), Cefepime 30 µg (FEP), Ceftriaxone 30 µg (CRO), Amoxicillin-clavulanic acid 20/10 µg (AMC), Meropenem 10 µg (MEM)

การแปลผลการทดสอบความไวต่อสารต้านจุลชีพ

จานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 1

ใช้ในการแปลผลการดื้อยาด้วยกลไก ESBLs และ AmpC ที่ใช้วิธีทดสอบยืนยัน(confirmatory test) โดยวิธี Combined disc ในการแปลผลการดื้อยาด้วยกลไก ESBLs โดยถ้า inhibition zone ของ cefotaxime-clavulanic acid และ/หรือ ceftazidime-clavulanic acid มีขนาดกว้างกว่า 5 mm เมื่อเปรียบเทียบกับ cefotaxime และ/หรือ ceftazidime ตามลำดับ ให้รายงานผลเป็น ESBLs บวก (รูปที่ 2) และทำการแก้ผลความไวของยาต้านจุลชีพในกลุ่ม beta–lactams เป็น resistance ทั้งหมด ยกเว้น cephamycins และ carbapenems ทั้งนี้การทดสอบคัดกรอง (screening test) ESBLs ต้องให้ผลบวกด้วย ตามตารางการแปลผลของ CLSI (ตารางที่ 3)


 
%d bloggers like this: